A capela do Palácio da Pena resultou da adaptação da antiga igreja monástica de Nossa Senhora da Pena.
Até à extinção das ordens religiosas, esta igreja estava aberta aos fiéis (que chegavam ao mosteiro da Pena através do Caminho dos Peregrinos), embora não tivesse função paroquial.
O retábulo do altar-mor da antiga igreja, em alabastro e calcário da região de Sintra, foi executado entre 1529 e 1532, pelo escultor de origem francesa Nicolau de Chanterene, e resultou de uma encomenda de D. João III, filho de D. Manuel I, o edificador do convento.
Destaque para o vitral de D. Fernando II, na parede oposta ao altar-mor, que data de 1840, pouco tempo depois do início da construção do Palácio, e foi executado na famosa oficina de vitrais de Nuremberga da família Kellner. O vitral revela as intenções artísticas, mas também de legitimação política, subjacentes à construção do Palácio.